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定量PCR還是數(shù)字PCR

隨著數(shù)字PCR技術(shù)應(yīng)用的展開(kāi)，越來(lái)越多實(shí)驗(yàn)室被其絕對(duì)定量的方式、結(jié)果的高靈敏度、高重復(fù)性等特質(zhì)所吸引。2012年年底，由Frost & Sullivan公司在北美市場(chǎng)進(jìn)行的調(diào)研顯示，約三分之一的被訪(fǎng)者表示會(huì)考慮購(gòu)買(mǎi)數(shù)字PCR設(shè)備。

那么，是否意味著目前在研究、臨床和工業(yè)領(lǐng)域內(nèi)，廣泛采用的熒光定量PCR技術(shù)將被淘汰？數(shù)字PCR很快就要將其徹di取代？越來(lái)越多實(shí)驗(yàn)室對(duì)陳斯卡提出類(lèi)似問(wèn)題。結(jié)合多年推廣定量PCR與近幾年投身數(shù)字PCR領(lǐng)域的經(jīng)驗(yàn)心得，陳斯卡談?wù)勛约旱捏w會(huì)，供大家參考。

陳斯卡總體的觀(guān)點(diǎn)是：雖然絕大多數(shù)定量PCR的應(yīng)用都可以使用數(shù)字PCR完成，但在可預(yù)期的將來(lái)，兩者將長(zhǎng)期共存。到底使用定量PCR還是數(shù)字PCR，取決于具體應(yīng)用和對(duì)數(shù)據(jù)的要求。兩者不是either/or的關(guān)系，而是both/and的關(guān)系。兩種技術(shù)平臺(tái)各自的特點(diǎn)與現(xiàn)狀大致可從下面8個(gè)方面說(shuō)明。

1.   在20多年的使用和發(fā)展中，定量PCR作為一種技術(shù)平臺(tái)，已經(jīng)產(chǎn)出海量的數(shù)據(jù)，在工業(yè)界和分子檢測(cè)的某些應(yīng)用上，定量PCR已經(jīng)成為“金標(biāo)準(zhǔn)”。基礎(chǔ)研究方面，則形成了被稱(chēng)為MIQE的“定量PCR標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)指南”。

2.   在定量PCR的各種應(yīng)用中，基因表達(dá)分析（gene expression analysis）的應(yīng)用比重約占七成，綜合各種因素來(lái)看，眼下定量PCR還是進(jìn)行基因表達(dá)研究的理想手段。

3.   上述的“各種因素”具體展開(kāi)，主要包括：通量、自動(dòng)化程度、各種檢測(cè)探針與染料、檢測(cè)通道、成本和可參考文獻(xiàn)與protocol的數(shù)目等等。

4.   就目前市場(chǎng)上已有的數(shù)字PCR設(shè)備來(lái)看，定量PCR在檢測(cè)的線(xiàn)性范圍上具有優(yōu)勢(shì)，意味著同一個(gè)run內(nèi)可對(duì)各種表達(dá)豐度的樣品進(jìn)行分析。

5.   目前定量PCR已經(jīng)能實(shí)現(xiàn)高通量樣品條件下的自動(dòng)化操作。

6.   數(shù)字PCR在單分子層面上的絕對(duì)定量，可以徹di擺脫對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的依賴(lài)而直接給出靶序列的拷貝數(shù)，提高了實(shí)驗(yàn)結(jié)果在批內(nèi)和批間的穩(wěn)定性，甚至能用來(lái)對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行定標(biāo)。

7.   基于絕對(duì)定量的方式，數(shù)字PCR結(jié)果的高重復(fù)性和高精度可實(shí)現(xiàn)微小差異的基因表達(dá)分析，如等位基因的不平衡表達(dá)、單細(xì)胞基因表達(dá)分析、microRNA表達(dá)分析等等。所謂“微小差異”的標(biāo)準(zhǔn)一般而言是指表達(dá)水平的差異在2倍以?xún)?nèi)。

8.   同等條件下，數(shù)字PCR在靈敏度方面擁有優(yōu)勢(shì)，使得該技術(shù)已成為腫瘤的液態(tài)活檢、病原微生物檢測(cè)、轉(zhuǎn)基因成分測(cè)定、宿主殘留DNA分析等的熱門(mén)技術(shù)。