由于細(xì)胞的高度透明性，觀察其中的細(xì)胞器十分困難。通過熒光染色，生物學(xué)家可以標(biāo)記特定的細(xì)胞器對其進(jìn)行觀察。絕大部分熒光分子在吸收或發(fā)射過程中，表現(xiàn)為有方向的偶極子。通過熒光偏振顯微鏡測量偶極子特性，能夠反映靶分子的取向特性，從而為研究靶分子的空間構(gòu)象和運(yùn)動特性提供重要信息。
 

　　為了打破傳統(tǒng)熒光偏振顯微鏡受光學(xué)衍射限制的問題，諸多超分辨熒光偏振顯微鏡技術(shù)被提出，如單分子定向定位顯微鏡(SMOLM)和偏振調(diào)制技術(shù)(SDOM、SPoD等)。然而，SMOLM在追求高空間分辨率的同時犧牲了時間分辨率，使得快速生物成像成為一項(xiàng)艱巨的挑戰(zhàn)。SDOM等偏振調(diào)制技術(shù)雖具有較高的時空分辨率，但只能求解偶極子的二維取向，缺乏解析偶極子三維取向的能力。三維取向能夠提供熒光分子更全面的三維空間結(jié)構(gòu)，因此，關(guān)鍵問題是如何打破時空分辨率和取向維度之間的權(quán)衡，實(shí)現(xiàn)超過衍射極限分辨率的同時，能夠快速成像和解析偶極子的三維方向。
 

　　針對偶極子取向解析問題，北京大學(xué)未來技術(shù)學(xué)院席鵬教授團(tuán)隊(duì)繼2016年提出二維偶極子取向映射方法SDOM(Light.: Sci. Appl., 2016)，及2022年基于光學(xué)鎖相探測的二維取向映射方法OLID-SDOM(Light.: Sci. Appl., 2022)后，為打破時空分辨率和三維取向維度的權(quán)衡瓶頸，開發(fā)了新型的三維取向映射顯微鏡(3DOM)。相關(guān)研究成果以“Three-dimensional dipole orientation mapping with high temporal-spatial resolution”為題，于2024年4月16日在線發(fā)表在PhotoniX期刊。
 

　　3DOM方法基于團(tuán)隊(duì)開發(fā)的偏振結(jié)構(gòu)光超分辨顯微技術(shù)，把楊氏雙縫干涉的原理反過來，結(jié)合光路可逆的原理，利用不同角度的條紋產(chǎn)生不同方向的正負(fù)一級光束。進(jìn)一步，只需要把相應(yīng)的負(fù)一級次光擋住，就可以產(chǎn)生單一方向的傾斜照明。把這一傾斜投影到z軸不同的角度，利用FISTA算法對圖像進(jìn)行重建，在倒易空間結(jié)合偏振調(diào)制系數(shù)和重建結(jié)果，即可實(shí)現(xiàn)高精度的偶極子取向解析。
 

圖1 三維取向映射顯微鏡原理圖
 

圖2 SYTOX Orange標(biāo)記λ-DNA的3DOM成像結(jié)果
 

　　研究結(jié)果表明，3DOM方法有效地克服了偏振熒光顯微鏡在使用寬場成像進(jìn)行高時空分辨率和三維方向映射方面的局限性，提供了更全面的熒光團(tuán)分子的三維空間結(jié)構(gòu)。這不僅能夠應(yīng)用于區(qū)分DNA、膜細(xì)胞器以及各種細(xì)胞骨架組織的宏觀形態(tài)(肌動蛋白絲和微管)，而且還可以獲得結(jié)構(gòu)的有序性和結(jié)合緊密度等有價值的信息。此外，3DOM的主要優(yōu)點(diǎn)之一是它易于在現(xiàn)有的寬場系統(tǒng)中升級，適用范圍廣，這增強(qiáng)了其在不同研究環(huán)境中的可及性和可用性。可以預(yù)見未來3DOM這個強(qiáng)大的工具將會有助于研究人員解析復(fù)雜的細(xì)胞器結(jié)構(gòu)，推動對眾多生物結(jié)構(gòu)和納米級相互作用的理解，為結(jié)構(gòu)生物學(xué)家、生物動力學(xué)家?guī)硇碌挠^察工具。
 

　　席鵬和生命科學(xué)學(xué)院李美琪老師為本文的共同通訊作者。北京大學(xué)未來技術(shù)學(xué)院博士生鐘素藝為該項(xiàng)成果的第一作者。該研究得到了科技部國家重點(diǎn)研發(fā)計劃、國家自然科學(xué)基金等項(xiàng)目的支持。
 

　　席鵬課題組致力于發(fā)展新型超分辨顯微成像技術(shù)，在偏振超分辨方面開展了如下工作：(1)利用偏振偶極子解析實(shí)現(xiàn)了50nm的超分辨與熒光二維偶極子測量(Light: Science and Applications 2016 ); (2)通過解析結(jié)構(gòu)光超分辨中的偏振信息，實(shí)現(xiàn)了偏振SIM超分辨(Nature Communications 2019)，并成功實(shí)現(xiàn)商業(yè)化；(3)結(jié)合熒光分子的化學(xué)極性(光譜紅移)與物理序性(偶極子自由度)信息，成功實(shí)現(xiàn)了10種細(xì)胞器的同時觀察與環(huán)境研究(Nature Communications 2020)；(4)通過偏振調(diào)制和光學(xué)鎖定放大技術(shù)來增強(qiáng)微弱的偏振調(diào)制信號，實(shí)現(xiàn)活細(xì)胞中亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的熒光各向異性的高靈敏度測量(Light: Science and Applications 2022)；(5)發(fā)展了具有偶極子方位解析能力的3D-SIM開源軟件Open-3DSIM(Nature Methods 2023 )和開源硬件(Advanced Photonics Nexus 2024)；(6)對相關(guān)的SIM重建算法進(jìn)行了系統(tǒng)綜述(Light: Science and Applications 2023) 。